1、黏附分子VLA-4等在HFRS免疫发病机制中作用的初步研究

①课题来源与背景：

国家自然科学基金专项基金项目，项目编号：30740021。

②技术原理及性能指标：

1）肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）的发病机制尚未完全阐明，过度活化的免疫应答和炎症反应可能是导致HFRS致病的主要原因。大量研究表明CTL 细胞攻击病毒感染的血管内皮细胞可能是造成全身微小血管弥漫性损伤的的重要原因之一。本项目采用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测HFRS患者血浆中可溶性细胞粘附分子VCAM-1配体缓慢抗原-4（VLA-4）、细胞间黏附分子-2（intercellular adhesion molecule-2, ICAM-2）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）以及淋巴细胞功能相关抗原3（lymphocyte function associated antigen-3, LFA-3）含量；并利用免疫细胞化学技术研究VLA-4在患者外周血单个核细胞（PBMC）膜表面的表达，观察这些免疫分子与HFRS发病阶段及严重程度之间的关系，探讨其在肾综合征出血热免疫发病机制中的作用。

2）利用PCR-SSP 技术对HFRS患者与人血管内皮细胞株进行HLA分型，筛选HLA-A位点基因型相同的HFRS患者PBMC和人血管内皮细胞株。分离配型成功的HFRS患者PBMC与血管内皮细胞株共同培养，并在培养体系中分别加入抗VLA-4、CD2、LFA-1单克隆抗体进行阻断实验，探讨造成HFRS患者血管内皮细胞损伤和渗透性增加的原因。

③技术的创造性与先进性：

1）粘附分子是由血管内皮细胞、白细胞及其它多种细胞产生，介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的众多分子的统称。粘附分子组成淋巴细胞激活的协同刺激信号, 介导细胞与靶细胞粘附，参与活化淋巴细胞。在疾病状态，粘附分子表达或脱落增加可致血清中可溶性粘附分子的水平升高。研究发现VLA-4、LFA-3和VCAM-1等在HFRS患者各个病期均升高，分别在低血压休克期或少尿期达峰值，且增高程度与病情严重程度呈显著相关性。因此，定量检测VLA-4 等粘附分子的表达水平可作为HFRS病程及病情观察的重要免疫指标。

2）建立HLA-A位点基因型相同的病毒特异性PBMC和血管内皮细胞株共培养系统，同时采用VLA-4、CD2、LFA-1特异性单克隆抗体进行阻断实验，观察血管内皮细胞损伤和滲透性的改变。结果表明HFRS患者PBMC可导致血管内皮细胞渗透性增高，但采用特异性粘附分子单抗进行的阻断实验可一定程度上逆转这一改变。结果提示上述粘附分子作为活化T细胞的协同刺激分子参与病毒特异性T淋巴细胞对血管内皮细胞损伤过程。

④技术的成熟程度，适用范围和安全性：

1）本项目采用的检测技术均为实验室常规技术，ELISA法具有操作简便，灵敏度高，特异性好，试剂稳定，结果容易判读等众多优点，而免疫细胞化学技术具有高度的特异性、敏感性、方法步骤统一，是一种综合定性、定位和定量密切结合的检测技术，这两种技术在基础科研平台、医学检验科及病理科得到广泛应用，因此用ELISA法监测HFRS患者体内多种免疫分子的变化和用免疫细胞化学技术研究VLA-4在患者PBMC膜表面的表达均是安全可行的。

2）西安地区人群HLA-A位点中基因频率最高的为A*02（30.04%）、 A*11（18.76%）、A*24（16.25%），为成功建立HLA-A位点基因型相同的HFRS患者PBMC和血管内皮细胞株提供了理论保证。本校建有符合国家标准可以进行病毒培养工作的实验室，课题组成员均具有有良好的科研素质，长期从事实验操作，熟练掌握课题所需要的细胞培养、PCR-SSP、HLA分型、单克隆抗体阻断等技术，因此保证了实验的安全顺利进行。

⑤应用情况及存在的问题： 

1）HFRS患者VLA-4等粘附分子与血管内皮细胞损伤密切相关，其作为重要的协同刺激分子在淋巴细胞活化及免疫效应阶段介导淋巴细胞与靶细胞（感染病毒的内皮细胞）间的粘附，VLA-4、sLFA-3、sVCAM-1等含量变化与疾病严重程度密切相关，其持续高水平可间接反映HFRS患者感染发病期间的免疫功能状态。因此，定量检测VLA-4 等粘附分子的表达水平可作为监测HFRS病情进展及严重程度的重要免疫指标。

2）HFRS患者血清中有多种免疫分子与HFRS病情进展及严重程度密切相关，临床希望能用微量的样本一次性检测更多分子的表达，提高检测范围及灵敏度。

⑥历年获奖情况：

此项目暂未获奖。