一、技术方案的论证

从2010年1月开始立项，我们查阅了有关书籍、资料和文献，在国内外现有研究的基础上，我们进行了认真的分析，对所确定的研究方案进行了严格的论证，书写本课题的医学研究综述。详细设计课题研究方案、实施步骤、研究方法和观察指标。认真筛选研究病例，严格掌握适应证，在不同研究方案中，对所选的病例均采用病例对照研究，严格执行各项实验操作，详细记录研究数据，认真做患者预后随访，严把研究环节，确保研究取得成功。

宫颈癌是危害女性健康最常见恶性肿瘤之一，在全球女性发病率位居第二位，每年造成30万人死亡，是造成发展中国家女性死亡的主要原因。宫颈癌早期可以通过手术治疗，晚期主要通过化疗和放疗来综合治疗。以铂类为主的化疗是宫颈癌的标准化疗，宫颈癌患者首次以铂类为主的化疗，复发后再次使用铂类药物治疗，60%都产生了耐药性。ⅡB-Ⅲ期宫颈癌5年生存率为30%-50%，Ⅳ期宫颈癌生存率仅为5%-15%。化疗耐药是晚期或复发宫颈癌治疗中非常棘手的问题。因此,克服化疗耐药，本研究旨在寻找宫颈癌的最佳靶向治疗方案。

二、技术特征：

研究对象

选择2010年2月至2011年1月在西安交通大学医学院第二附属医院阴道镜下接受宫颈活检及住院接受手术的宫颈癌患者为研究对象，取材均获得患者的知情同意。采集标本时取两份宫颈组织块，一份行病理学检查一份置入-30℃冷冻保存备检。

主要实验仪器  

仪器名称 厂家 型号

PCR扩增仪 东胜创新生物科技有限公司 EDC-810

台式离心机 上海安亭科学仪器厂 TGL-16B

恒温水浴锅 长风公司 HSG-IB-2

稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-6B

电子分析天平 日本岛津公司 AY120

超净工作台 苏净集团安泰公司 SW-CJ

可调式移液器 Finnpipette 公司

漩涡混合仪 上海兴行实业有限公司 XW-80A

微量进样器 陕西新莱博生物有限公司

凝胶成象仪 陕西沃森生物基因技术股份有限公司 XK2100

水浴锅 长风公司 HW.SY21-K

手掌型离心机 江苏海门市其林贝尔仪器有限公司 LX-100

主要试剂

血液/组织/细胞基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白酶K购自天根生化科技(北京)有限公司；Taq DNA聚合酶、10×buffer A、dNTP、MgCl2均为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；溴化乙锭、琼脂糖(Agarose)购自基因工程上海有限公司；D2000 公司根据Genbank公开发表的人EGFR基因序列(编号NG_007726),利用Oligo6.0软件设计EGFR的第18、19和第21外显子PCR引物，引物由上海生工生物工程公司合成。PCR引物序列及片段长度见表1

表1 EGFR外显子18、19及21PCR引物序列及片段长度

外显子          正向引物                     反向引物              片段长度

  18    5'-catggtgagggctgaggtga-3'   5'-ccagagg(a*)ctgtgccagggac-3   199bp

  19    5'-gtgcatcgctggtaacatcca-3'  5'-ggagatgagcagggtctagagca-3    294bp

  21    5'-tggcatgaacatgaccctgaa-3'  5'-cagcctggtccctggtgtc-3        295bp

 宫颈癌组织DNA提取

宫颈癌组织DNA的提取参照天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

 EGFR外显子18、19及21的PCR扩增所有PCR的循环参数设置均为94℃变性4分钟，然后94℃ 20秒, 57℃ 40秒,72℃ 30秒,共35个循环后, 72℃延伸5分钟，4℃保存。

扩增产物的观察与鉴定

每一PCR反应终止后均取10μL扩增产物与1/10体积上样缓冲液混合，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳：1 TAE电泳缓冲液（40 mmol/L Tris-乙酸，1.0 mmol/L EDTA），0.5 mg/mL 溴化乙锭染色，5V/cm电泳20min~30min后于紫外灯下观察拍照。

 PCR产物序列测定

    分别取EGFR外显子18、19和21相应PCR产物各30μL，由天根生化科技（北京）有限公司ABI 3730XL测序仪测序。所获序列经http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/进行分析。

 统计学分析

统计学分析均采用SPSS13.0软件,使用Pearson'X2检验或Fisher精确检验,比较EGFR基因突变组与未突变组与患者临床资料如疾病临床分期、病理类型、年龄、肿瘤直径间经等的差异，通过Logistic回归进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

三、结论：

国内未见与本课题查新点（宫颈癌组织表皮生长因子受体基因中是否存在与EGFR酪氨酸激酶抑制剂药物敏感性相关的18、19及21外显子突变。）内容相同的文献报道。

四、创新点：

1、本项目系统阐述了宫颈癌的靶向治疗进展。

2、本项目重点研究并旨在探寻宫颈癌组织表皮生长因子对敏感性相关的基因突变研究。