出血性脑损伤疾病具有高残死率的特点。出血性脑损伤不仅是由于出血占位效应及其对周围脑组织的直接破坏，而且继发性脑损伤也是出血后脑损伤的重要原因。目前观点认为，细胞凋亡在出血性脑损伤中起着重要作用，然而目前并不清楚出血性脑损伤后凋亡具体激活通路、在体细胞凋亡时空分布规律及其抑制方法。出血性脑损伤的病理变化并不局限于凋亡损伤一种机制。有研究发现，出血动物模型中Ca2+的变化亦参与了脑损伤的形成，但具体机制仍需进一步研究。至今为止，对出血后神经功能损害尚无确切有效的治疗手段。由于出血性脑损伤后早期伴发严重神经细胞损害和脑微环境改变，故采用脑细胞移植可作为一种新的神经修复方法。然而，目前关于脑细胞移植和神经功能重建的方法和确切机制仍未阐明。流行病学资料显示，出血性脑损伤疾病严重危害人类健康，如何早期诊断并进行个体化治疗是目前临床亟待解决的问题。因此，本研究以出血性鼠脑模型为研究对象，采用行为学、细胞培养、免疫组化、电生理、分子生物及细胞移植等方法，明确在体诱导鼠脑细胞凋亡时间和空间分布规律基础上，阐明出血后脑损伤中各种病理机制，最终明确脉络丛细胞重建受损的神经通路和改善脑部微环境的机制及治疗效果。

本课题前期研究结果表明，脉络丛细胞移植能促进ICH后神经再生，并有稳定性强、无致瘤性与存活率高等优点，可作为脑内移植的种子细胞，但其具体作用机制尚待进一步研究。本课题在原有脉络丛细胞移植促进ICH后神经再生动物实验研究工作的基础上，通过移植人胚胎脉络丛上皮细胞，观察移植前后宿主脉络丛及相关脑区细胞因子和基因的表达情况，并对其神经功能作评估，研究人胚胎脉络丛上皮细胞介导CH后神经再生的作用及机制，为ICH采用人胚胎脉络丛上皮细胞移植治疗的应用提供实验依据。

研究成果：

1）改良了脉络丛上皮细胞的培养方法，成功进行了人胚胎脉络丛上皮细胞的培养，并对脉络丛上皮细胞进行了鉴定和形态学观察。本课题组在已有的机械分散法基础上进行了方法学的改良，成功地进行了人胚胎脉络丛上皮细胞的体外培养。即在无菌条件下分离12周龄人胚胎脉络丛组织，经机械分离后将细胞种植于DMEM/F12和DMEM低糖培养基中，在培养早期成功抑制了成纤维细胞的生长，定期进行形态学观察并摄片。在培养12天时，采用电镜观察和免疫组织化学法染色进行鉴定，并计算脉络丛上皮细胞的纯度。结果显示，培养的人胚胎脉络丛上皮细胞呈鹅卵石样团簇生长，TTR明显表达，细胞纯度达95%以上。研究表明，改良的机械分散法成功地培养了人胚胎脉络丛上皮细胞，培养方法简单实用高效，获得了高纯度的人胚胎脉络丛上皮细胞。

2）证实BDNF和NGF在体外培养的人胚胎脉络丛上皮细胞中明显表达，本课题组在参考国内外相关文献和前期研究基础上，完成了对体外培养人胚胎脉络丛上皮细胞分泌BDNF和NGF能力的检测。采用qRT-PCR法、Western Blot法和Elisa法检测原代和传代人胚胎脉络丛上皮细胞的BDNF和NGF的表达情况。结果显示，BDNF随传代次数增加分泌逐渐减低，NGF在原代培养的细胞中表达较低，在传一代细胞中表达明显增加，传二代细胞较传一代细胞表达减低，但高于原代培养细胞。

3）证实ECRG4是与人胚胎脉络丛上皮细胞损伤具有高度相关性的细胞因子，本课题组在参考国外文献的基础上，首次对人胚胎脉络丛上皮细胞中 ECRG4 的表达进行检测。采用qRT-PCR法、Western Blot法和Elisa法检测原代和传代人胚胎脉络丛上皮细胞的ECRG4表达情况，结果显示ECRG4与TTR表达具有相关性，可能参与了脉络丛上皮细胞早期对于脑损伤的反应。

4）证实人胚胎脉络丛上皮细胞对脑出血大鼠的治疗作用，本课题组在前期实验的基础上，进行大鼠脑血肿腔内移植脉络丛上皮细胞实验。通过对大鼠海马细胞 caspase-3 的表达研究，证实脑出血早期进行血肿腔移植人胚胎脉络丛上皮细胞可以减低大鼠海马细胞中 caspase-3的表达，从而减少大鼠海马神经细胞的凋亡。实验采取脑出血后3、7天、14天和21天进行血肿腔脉络丛上皮细胞移植。HE染色显示脑出血组大鼠海马 CA1、CA3区神经元数量较实验组明显减少，主要表现为较多的细胞胞体缩小，胞浆浓缩，核固缩，整个细胞深染，此种表现随时间推移表现愈加明显。移植组大鼠海马CA1、CA3区细胞形态的改变，与同时间段对照组比较明显减少。免疫组化染色显示脑出血组大鼠海马有散在分布的阳性细胞，染色较浅，随时间的推移阳性细胞不断增加，染色加深，caspase-3 阳性反应为黄色成棕褐色，定位于胞浆，亦可见于胞膜和胞核。染色不着色为阴性，显示淡黄色为弱阳性，棕褐色为强阳性。移植组大鼠海马caspase-3的表达均较同时间点脑出血组程度轻。

5）脑出血后大鼠神经行为学评分，本实验通过对脑出血组大鼠和移植组大鼠进行神经行为学评分，证实脉络丛上皮细胞移植后7天和14天，移植组大鼠神经功能较脑出血组明显改善。