植物次生代谢途径多样性，呈明显代谢途径状，然而植物自身固有的代谢途径相对实际应用而言其遗传特性并非最佳，为了更多地获得活性天然产物，需要对细胞的代谢途径进行功利性的修饰。

植物代谢工程的基本原理及其应用战略就是在这一发展背景下形成的，它为人们提供了一条既无损于资源又可满足人类对植物药品需求的两全之策。

整合基因组学、转录组学以及代谢组学筛选丹参活性成分合成相关基因对探讨丹参优良种质形成的分子机理具有重要的意义。

随着分子生物学和功能基因组学研究的不断深入，丹参酚酸类成分的合成调控机制正在逐步地被揭示。

诱导子被广泛地应用于丹参酚酸类成分的合成调控中，在生产和基础理论研究中发挥了重要作用。

迷迭香酸生源途径上上游主要的关键酶基因已经全部被克隆，下游基因需要进一步的研究和探索。

丹参迷迭香酸代谢途径支路酪氨酸支路上面的关键基因SmTAT、SmHPPR和SmHPPD基因和下游的关键基因RAS已经有相关的报道，但是它们间相互的调控和他们与迷迭香酸代谢其他相关基因的调控关系与迷迭香酸和丹酚酸B的累积之间的关系尚没有明确定论。

本文在前人研究的基础上，对迷迭香酸代谢支路酪氨酸支路相关基因进行了克隆和功能研究，进一步探索这些基因的调控与酚酸类累积的关系。

具体工作如下： （1）利用同源克隆的方法从丹参中获得了酪氨酸氨基转移酶、4-羟基苯丙酮酸还原酶和迷迭香酸合成酶的核苷酸序列，分别命名为SmTAT? (GenBank accession No.：KM575934)、SmHPPR(GenBank accession No.：KM591599??)和SmRAS(GenBank accession No.：KM575933)。

对其进行基因组DNA分析表明，SmTAT基因组DNA全长4.8kb，由5个内含子和6个外显子组成，cDNA长度为1603 bp，包含一个1236bp的ORF，编码411个氨基酸。

SmHPPR基因组DNA全长2114 bp，包含1个内含子和2个外显子，cDNA序列长度为1066 bp，包含一个939 bp的ORF，编码313个氨基酸。

SmRAS基因组由1个内含子和2个外显子组成，cDNA全长1489 bp，包含一个1284 bp的ORF，编码428个氨基酸。

（2） 构建SmTAT、SmHPPR和SmRAS的超表达表达载体和SmTAT、SmHPPR、SmRAS和SmHPPD的RNAi沉默表达载体，利用根癌农杆菌ATCC15834介导的植物转化体系获得超表达植株和RNAi沉默植株，研究SmTAT、SmHPPR、SmRAS和SmHPPD在丹参酚酸类成分合成积累中的作用。

结果发现SmTAT、SmHPPR和SmRAS的过表达显著（P<0.05）促进了丹参中酚酸类成分的积累，增加了丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B含量。

SmTAT、SmHPPR、SmRAS的RNAi沉默表达显著（P<0.05降低了丹酚酸B和迷迭香酸的含量，然而SmHPPD RNAi沉默表达显著（P<0.05却增加了丹酚酸B和迷迭香酸含量。

SmTAT、SmHPPR和SmRAS三个基因的超表达较明显的导致了酚酸类合成途径上其他基因的上调或者下调，SmTAT、SmHPPR、SmRAS的RNAi沉默表达显著下调了丹参酚酸类合成途径上其他基因的下调，SmHPPD RNAi沉默表达显著上调了了丹参酚酸类合成途径上其他基因，证明了SmTAT、SmHPPR和SmRAS这三个基因在迷迭香酸和丹酚酸B合成中的重要作用。

（3）构建绿色荧光蛋白融合表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，培养后在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白的亚细胞定位情况。

结果在转化pTF-486空载体的洋葱表皮细胞中，绿色荧光蛋白散布于整个细胞中。

在转化pTF-486-SmRAS和pTF-486-SmTAT的洋葱表皮细胞中，在细胞核和细胞质部位观察到了绿色荧光蛋白的分布。

而在转化pTF-SmHPPR的洋葱表皮细胞中，细胞质和细胞膜部位均观察到了绿色荧光。

说明pTF-486-SmRAS定位于细胞核外，还可能定位在细胞质；而和pTF-486-SmTAT和pTF-SmHPPR除定位于细胞质外，还可能定位于细胞膜。

（4） 利用发根农杆菌ATCC15834获得转基因毛状根，并在获得的毛状根中添加Ag+和水杨酸诱导子，研究SmTAT、SmHPPR和SmRAS的超表达表达和SmTAT、SmHPPR、SmRAS和SmHPPD RNAi沉默和诱导子添加协同作用对丹参毛状根中酚酸类成分合成积累的影响。

Ag+和水杨酸诱导子同样提高了丹参毛状根中酚酸类成分的含量，但SmTAT、SmHPPR和SmRAS的超表达和诱导子协同作用更加高效地促进了丹参毛状根中酚酸类成分的合成积累，协同处理组中迷迭香酸和丹酚酸B的含量分别达到了未加任何处理的野生型毛状根中的2.8倍、3.2倍（Ag+）和3.2倍、3.8倍（水杨酸);与SmTAT、SmHPPR、SmRAS和SmHPPD RNAi沉默和诱导子协同作用较好的恢复了因SmTAT、SmHPPR和SmRAS RNAi导致的酚酸成分下调的累积，维持到了野生丹参的水平。

证明了诱导子和转基因毛状根协同作用更为有利于丹参迷迭香酸代谢中酚酸类的累积，为生产上提高丹参酚酸类有效成分的质量和品质提供了可行的技术手段。

综上所述，本研究通过对迷迭香酸代谢酪氨酸支路上关键酶基因和下游关键基因RAS的克隆研究，拓展了人们对酚酸类化合物生物合成累积与基因调控的认识，帮助人们更加系统深入的理解酚酸类的生物合成机制，从而极大的推荐丹参中酚酸类成分的代谢工程研究。