本发明公开公开了一种通用型基因打靶载体的构建方法，该方法选择正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)，其中，在正选基因(neo)的两端加入Loxp序列，将正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)分别连入克隆载体pGEM-3Z，合成含有Bsp14071，Nhe1，Not1，Bsu151(Cla1)，Bst11071，Pf12311，Spe1，Pst1，SacII稀少酶切位点的序列，将这段序列插入正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间，正选基因(neo)和两个负选基因(HSV-tk1)之间的酶切位点为稀少的酶切位点，从而便于不同基因作为同源臂插入。在基因打靶载体正选基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除正选基因。