本发明公开了一种透明质酸分离纯化的方法，将得到的透明质酸提取物加入到碱性缓冲水溶液中，并加入胰蛋白酶，在常温下搅拌；向上述混合液中加入卤苯，搅拌，然后离心抽取上清液；向上述清液中加入0.15mol/L-0.25mol/L的氯化钠，并搅拌溶解，然后加至少2.5倍体积的95％以上的乙醇并搅动，静置至沉淀发生后离心，沉淀物既为分解蛋白质的透明质酸。本发明方法操作步骤少，操作简便；生成的产品成本费用低，产品质量好。