缺氧反应元件基因治疗质粒及其构建方法，以人工DNA合成法制备5个拷贝的缺氧反应元件的核心序列和CMV最小启动子序列，以定向克隆法将拷贝的缺氧反应元件的核心序列和CMV最小启动子序列段替换质粒载体pGL3-PromoterVector的SV40启动子，构建成pGL3-5HRE-CMVmp质粒；以pEGFP-N1真核表达载体为模板，采用PCR扩增制备EGFP片段，以定向克隆法将制备的EGFP片段替换质粒pGL3-5HRE-CMVmp的Luciferase片段，从而构建成pEGFP-5HRE-CMVmp载体。本发明的构建方法得到的质粒启动子序列可使载体携带的目的基因的表达受控于组织细胞内氧信号的调节；使载体携带的目的基因在特定的组织或细胞内表达；可与目的基因融合表达，便于检测目的基因的转染效率和细胞内定位。