一、课题来源与背景

    本课题来源于陕西省科学技术研究发展计划项目，项目编号：2013K12-23-02。

    汉中植物研究所联合陕西省食药用菌工程技术研究中心、汉中市环境监测中心站和汉中市农业科学研究所，针对近年来内生真菌产紫杉醇含量普遍偏低、缺乏稳定高产的适于发酵的工业菌株、发酵条件的不合理限制了单位发酵液中紫杉醇的含量等问题开展攻关。

    二、技术原理及性能指标

    （1）本研究以提高微生物发酵法生产紫杉醇的产量为目标，从秦巴山区野生红豆杉中分离得到109株内生真菌，经纯化获得82株内生真菌。采用UV、HPLC和HPLC-MS检测方法，对82株内生真菌的发酵液中代谢产物进行检测，并通过形态学特性研究和ITS序列分析，鉴定物种。

    （2）以紫杉醇产量为指标，利用HPLC进行检测，通过单因素实验，确定了葡萄糖、硝酸铵和无水硫酸镁的最适浓度，进一步采用L9(34)正交试验，得到了三者在培养基中的最佳组合，从而得到最佳发酵培养基组成。

    三、技术的创造性与先进性

    （1）在8株产紫杉醇内生真菌中，Metarhizium anisopliae LB-10是一株高产紫杉醇的内生真菌，经过形态学特性研究和ITS序列分析，鉴定该菌株为绿僵菌属真菌，而目前，有关绿僵菌属真菌产紫杉醇方面报道较少。通过UV、HPLC及HPLC-MS对其发酵产物的检测分析，判定其产生紫杉醇，含量达到846.1 μg/L，和已报道的紫杉醇生产真菌相比，该菌株产量较高。

    （2）通过单因素试验和正交试验，获得了最佳发酵培养基组成(g/L)：葡萄糖50.0，NH4NO3 6.0，无水MgSO4 0.3，KH2PO4 0.5，VB1 5.0×10-2，其紫杉醇含量达到938.6 μg/L，产量提高了92.5 μg/L。

    四、技术的成熟程度、适用范围和安全性

    从可持续发展的角度来看，利用植物内生真菌作为药源是不会枯竭的。可望解决市场上供不应求、价格昂贵的现状，且对于研究濒危药用植物的保护及植物来源的天然药物的新生产途径的开发，具有十分重要的意义。

    通过开展秦巴山区野生红豆杉内生真菌代谢产紫杉醇发酵工艺条件研究，形成一整套完整的内生真菌代谢产紫杉醇发酵工艺技术，该项目的实施不仅帮助解决药用植物野生资源短缺问题，同时能够挽救和保护珍稀濒危物种，具有显著的社会效益和经济效益。该项目投入工业化生产后，产生直接经济效益上千万元，对于调整农业产业结构，发展农村经济，增加农民收入和推动中药产业可持续发展等均有重要意义。

    五、应用情况及存在问题

    项目下达以来，课题组成员团结协作、克服困难、抓紧时间、努力工作，完成了项目任务书中的各项研究和建设任务。但因时间紧，经费少等因素，还存在需要进一步研究解决的问题，从目前研究水平来看，真菌发酵液中紫杉醇的产量仍然不高，要进行工业化生产，提高真菌发酵液中紫杉醇的产量是今后研究工作的重心。

    由于紫杉醇合成路线、调控规律以及中间体还不清楚，影响了最佳发酵营养条件的确立。随着紫杉醇生物合成途径的深入研究，充分地应用现代生物学技术，对能够产紫杉醇的内生真菌进行遗传改造，构建高产紫杉醇工程菌株，从而提高紫杉醇的产量，是最有效的途径，到时将实现微生物发酵法产生紫杉醇的工业化生产，既能够解决了紫杉醇的药源问题，改善目前市场上紫杉醇供不应求、价格昂贵的现状，又可保护濒临灭绝的珍稀红豆杉树种。

    六、历年获奖情况

    该研究获得了8株内生真菌代谢产生紫杉醇，其中有1株高产紫杉醇内生真菌LB-10，鉴定该菌株为绿僵菌（Metarhizium anisopliae）；根据该项目的研究成果，课题组在2014年——2016年三年期间，共发表5篇学术论文：

[1] 赵赟鑫, 张欢. 关于红豆杉资源及其主要化学成分研究进展[J]. 汉中科技, 2014,4:1-3.

[2] 赵赟鑫, 张欢. 紫杉醇及其生物合成路径研究进展[J]. 汉中科技, 2014,5:1-3.

[3] 赵赟鑫, 张欢, 邓百万等. 红豆杉内生真菌产紫杉醇的培养基优化[J]. 江苏农业科学, 2014,42(11):389-392.

[4] 赵赟鑫, 高文, 张欢等. 提高红豆杉内生真菌及紫杉醇含量的途经分析[J]. 陕西农业科学, 2015,61(10):13-17.

[5] 张欢， 赵赟鑫, 高文等. 紫杉醇生产现状的分析与对策[J]. 中国现代中药, 2016,18(1):126-130.

    2015年12月31日，论文“红豆杉内生真菌产紫杉醇的培养基优化”获得汉中市人民政府颁发的汉中市自然科学优秀学术论文三等奖，证书号：DSJS46。