本发明公开了一种能鉴别猪瘟疫苗毒株和流行毒株反转录-复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，由反转录混合液、一扩混合液、二扩混合液、阴性对照和阳性对照组成。还公开了该试剂盒的检测方法。该方法针对猪瘟病毒NS5B基因设计5条引物，S1、S2为疫苗毒株与流行毒株外扩通用引物，S3、S4为疫苗毒株与流行毒株内扩通用引物，S5为疫苗株内扩特异性引物。经过引物浓度、聚合酶浓度、退火温度等优化，建立了鉴别诊断方法。本发明方法灵敏度高，特异性好，既能检测出流行毒株感染，又能判断是否是疫苗接种阳性，结果直观准确，适用于大范围猪瘟疫情普查诊断，避免误诊造成的损失。