我国牛羊养殖业效益低下，同时又面临乳腺炎、结核和布病等重大疾病的严重威胁。完全依靠常规技术已经难以解决这些问题。整合酶介导的基因定点整合技术、锌指核酸酶介导的基因打靶技术、TALE核酸酶介导的基因打靶技术的相继出现，并在小鼠和人类细胞基因编辑方面应用，显示出强大的基因编辑功能，将转基因技术带入基因定点插入和精确编辑时代，为解决牛羊养殖业的上述两大问题提供了新机遇。但是，上述技术仍然存在以下问题限制了其在牛羊等大家畜上应用：整合酶介导的基因定点整合技术不能完全排除随机整合及其引发的目的基因沉默和随机插入突变，载体的菌性骨架插入牛羊基因组影响转基因事件的安全性；锌指核酸酶和TALE核酸酶介导的基因打靶技术在动物的基因敲除方面表现出强大功能，但在特定靶位点精确插入目的基因的难度很大，更重要的是因非特异性切割产生双链断裂引发高脱靶效应，严重影响转基因安全性和成功率。针对上述问题，本项目开展了牛羊基因定点整合和精确编辑技术研究。取得如下重要创新。

1、在牛基因组中发现七个新的假attP位点；采用attB-TK融合蛋白进行负筛选排除了随机整合，用Cre酶和Dre酶切除筛选基因和菌性载体骨架；建立了由PhiC31整合酶介导的高效、安全基因定点插入技术。分别将“β-酪蛋白启动子+人β-防御素3基因”、“Muc1启动子+人β-防御素3基因”和“β-酪蛋白启动子+人血白蛋白基因”单拷贝定点插入牛成纤维细胞的假attP位点，通过转基因体细胞克隆技术，研制出人β-防御素3基因定点插入抗乳腺炎奶牛、人β-防御素3基因定点插入抗结核奶牛和人血清白蛋白基因定点插入奶牛。

2、通过对锌指核酸酶切割结构域FokI进行点突变，研制出特异性切割产生DNA单链断裂的锌指切口酶，建立了锌指切口酶介导的基因精确插入技术，规避了锌指核酸酶的脱靶效应。将溶葡萄球菌素和人溶菌酶基因分别定点插入牛体细胞的β-酪蛋白基因座，研制出溶葡萄球菌素基因打靶抗乳腺炎奶牛和人溶菌酶基因打靶抗乳腺炎奶牛。

3、研制出特异性切割产生DNA单链断裂的TALE切口酶，创建了TALE切口酶介导的基因精确插入技术，规避了TALE核酸酶的脱靶效应。将Ipr1基因定点敲入牛成纤维细胞的SP-A和MAT1A基因之间，通过转基因体细胞克隆技术，研制出Ipr1基因定点敲入抗结核克隆奶牛；在敲除一侧β-乳球蛋白基因后将人乳铁蛋白精确插入到对侧等位基因，获得β-乳球蛋白基因完全敲除和人乳铁蛋白插入的奶山羊。

4、将基因定点整合和精确编辑技术与体细胞高效克隆技术有机集成，创建了安全高效的牛羊基因精确编辑集成技术体系。利用该技术体系，首次培育出人β-防御素3基因定点插入抗乳腺炎奶牛、溶葡萄球菌素基因打靶抗乳腺炎奶牛、人溶菌酶基因打靶抗乳腺炎奶牛、Ipr1基因定点敲入抗结核克隆奶牛、人β-防御素3基因定点插入抗结核奶牛5个抗病育种材料和人血清白蛋白基因定点插入奶牛、人乳铁蛋白定点敲入奶山羊两种乳腺生物反应器。

围绕上述研究，申报国家发明专利12项，其中授权8项；在ProcNatlAcadSciUSA、NatureCommunications、StemCells、Proc.R.Soc.B和ScientificReports等国际著名学术刊物发表研究论文18篇。

本项目创新和发展了动物转基因技术体系，对推动抗病生物学、基因工程育种和乳腺生物反应器技术的发展，提升我国牛羊业种质创新和育种水平具有重大意义，具有广阔应用前景。